17β-雌二醇( 17β-Estradiol，E2) 是常見的內分泌干擾物之一，環境中存在的 E2 可直接或間接進入 生物體，具有致癌致畸效應． 因此，開發簡單、靈敏和高選擇性的 E2 檢測技術十分必要． 傳統的 E2 檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用技術、酶聯免疫技術和電化學方法等． 這些檢測方法或需要精密儀器，或檢測步驟繁瑣，而且電化學方法直接測定 E2 的靈敏度和選擇性還 有待提高．

1 實驗部分

1．1 試劑與儀器

17β-雌二醇( E2) 、雌三醇( E3) 、雙酚 A( BPA) 和對苯二酚( HQ) 均為分析純，購于北京百靈威科技有限公司; 氯金酸( HAuCl4·4H2O，分析純) 和硫堇( THI，分析純) 購于國藥集團化學試劑有限公 司; 納米二硫化鉬分散液( MoS2，分析純) 購于南京牧科納米科技有限公司; 17β-雌二醇適配體 ( 17β-Estradiol aptamer DNA) 和部分互補單鏈 DNA( cDNA) 經高效液相色譜( HPLC) 純化，由生工生物 工程( 上海) 股份有限公司合成，其堿基序列分別為 Aptamer DNA 5'-SH-( CH2 ) 6-GCT TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C 和 cDNA 5'-SH-( CH2 ) 6-TTT GAG CTT CCG CGC TTC AGC GCG CAG CAA; 實驗用水為超純水． CHI660E 型電化學工作站( 上海辰華儀器公司) ，實驗采用三電極系統: 二硫化鉬/納米金修飾玻 碳電極( GNPs-MoS2 /GCE) 為工作電極，飽和甘汞電極( SCE) 為參比電極，鉑片電極為對電極; SU8220 型場發射掃描電子顯微鏡( SEM，日本 Hitachi 公司) ; UV-2550 型紫外-可見分光光度計( 日本島津公 司) ; 昆山舒美KQ-100DB 超聲波清洗機( 江蘇昆山超聲儀器公司) ．

1．2 電化學適配體傳感器的制備及測定

參考方法合成納米金溶膠( GNPs) ，用紫外-可見分光光度計表征 GNPs 的特征吸收峰為 519 nm． 參照方法進行玻碳電極( GCE) 的預處理． 電化學適配體傳感器的制備及原理如 Scheme 1所示． 參照方法制備 GNPs-MoS2 修飾電極: 將 1 mg /mL MoS2 溶液超聲分散 2 h，取 5 μL滴涂于預處理好的 GCE 表面，室溫下自然晾干． 將 MoS2 修飾電極置于含 6 mmol /L 氯金酸的 0. 1 mol /L KCl 溶液中，在－0. 2 V( vs． SCE) 恒電位條件下沉積 80 s，即得到 GNPs-MoS2 修飾電極． 將 5 μL 1. 0×10－6 mol /L 適配體 DNA 滴涂到修飾電極表面，于 4 ℃ 冰箱中放置 12 h，分別用超純水和 0. 01 mol /L Tris-HCl( pH = 7. 4) 緩沖溶液沖洗吸附的適配體 DNA． 為了防止非特異性吸附，將電極浸泡 于1 mg /mL的牛血清白蛋白( BSA) 溶液中，于 38 ℃放置 1 h 后，用超純水和 0. 01 mol /L Tris-HCl 緩沖 溶液( pH = 7. 4) 沖洗表面，再與 1. 0×10－6 mol /L 部分互補 cDNA 于 38 ℃雜交反應 70 min． 在雜交后的 電極表面滴加 9 μL 合成的 GNPs，室溫下避光靜置 4 h; 再置于 0. 25 mmol /L 的 THI 溶液中避光靜置 50 min后，用超純水和 0. 01 mol /L Tris-HCl 緩沖溶液( pH = 7. 4) 沖洗以除去未吸附的 GNPs 和 THI，獲 得適配 體 傳 感 器 ( THI-GNPs / dsDNA /BSA / ssDNA /GNPs-MoS2 /GCE) ． 在 5 mmol /L K3［Fe ( CN) 6］/ 5 mmol /L K4［Fe( CN) 6］/10 mmol /L KCl 溶液中，采用循環伏安( CV) 法和電化學交流阻抗( EIS) 法對 傳感器進行表征．

室溫下，將制備的傳感器置于不同濃度的 E2 溶液中反應 50 min，反應結束后用超純水和 0. 01 mol /L Tris-HCl 緩沖溶液( pH = 7. 4) 沖洗電極表面，然后置于 0. 01 mol /L Tris-HCl 緩沖溶液( pH = 7. 4) 中，采用差分脈沖伏安( DPV) 法對 E2 進行定量測定，記錄 THI 的氧化峰電流，用反應前后目標物 E2 的 ΔI［ΔI = I0－I) ［其中，I0( μA) 為反應初始電流; I( μA) 為反應后的電流，ΔI( μA) 為反應前后的電流 變化］進行定量分析．

2 結果與討論

圖 1 為 MoS2 /GCE 和 GNPs-MoS2 /GCE 的 SEM 照片和能譜分析( EDS) 圖． 由圖 1( A) 可知，納米 MoS2 呈層狀薄片分布，片層之間有孔道． 由圖 1( B) 可見，20 ～ 30 nm 的顆粒物分布在 MoS2 層狀薄片 上，表明 GNPs 已制備． 在圖 1( C) 中可以觀察到 Mo，S，C 和 O 的峰，在圖 1( D) 可以觀察到 Au，Mo， S，C 和 O 的峰，其中 C 和 O 為 GCE 電極的基體元素，Mo 和 S 峰為 MoS2 的峰． 而 Au 峰的存在進一步 證明 MoS2 表面分布的顆粒物為 GNPs．

THI 具有良好的電化學氧化還原可逆性和穩定性，近年來被作為電化學免疫傳感器和電化學 DNA 傳感器的電化學指示劑． GNPs 作為信號物質載體，可與 THI 分子形成金-硫、金-氮鍵合作用及 Fig．3 CV response of the electrochemical aptasensor interacted with different concentrations of E2 in 0. 01 mol /L Tris-HCl solution ( pH= 7. 4) cE2 /( mol·L－1 ) : a． 0; b． 1. 0×10－13 ; c． 1. 0×10－12 ． 靜電吸附作用，從而制備 GNPs /THI 電化學指示 劑; GNPs 的大比表面積為 THI 提供了大量結合位 點，可實現電化學信號的放大．

3 結 論

基于雙信號放大建立了電化學適配體傳感器檢測 E2 的分析方法． 實驗結果表明，該方法檢測 E2 的檢出限為 4. 2×10－15 mol /L( S /N= 3) ． 該方法檢出限較低、線性范圍較寬、特異性較好，可用于環境 水樣中 E2 的檢測，并有望用于其它環境樣品中 E2 的測定．



 

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