維生素 K( vitamin K) 是一類(lèi)以 2-甲基-1，4- 萘醌為基本結(jié)構(gòu)的化學(xué)物，自然界中主要形式有 維生素 K1( vitamin K1 ) 和維生素 K2( vitamin K2 ) 。 維生素 K1 是來(lái)自植物性食物的葉綠鯤; 維生素 K2 則是主要來(lái)自于微生物發(fā)酵產(chǎn)生的甲萘醌。 維生素 K2 由于側(cè)鏈上異戊二烯基團(tuán)數(shù)量不同而 可分 為 不 同 的 亞 型 并 采 用 n 烯 甲 萘 醌 ( menaquinone-n，MK-n) 進(jìn)行表示，其中比較常見(jiàn) 的有四烯甲萘醌( menaquinone-4，MK-4) 、七烯甲 萘醌( menaquinone-7，MK-7) 等。維生素 K 除了 作為凝血必需的輔酶因子外，近年來(lái)越來(lái)越多的 研究顯示它在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、骨骼代謝等方面都 發(fā)揮著重要作用。 不同生物體的不同部位維生素 K 所呈現(xiàn)的 形式及含量水平是有所差別的。動(dòng)物體內(nèi)一方面 可將膳食攝入的維生素 K1 轉(zhuǎn)化為維生素 K2 并得 以儲(chǔ)存，一方面可通過(guò)共生菌合成一定的維生素 K2，而不同的菌群可能產(chǎn)生不同形式的 MK-n。 目前有關(guān)維生素 K 的研究主要集中在植物性維 生素 K1 和來(lái)自納豆芽孢桿菌的 MK-7，而有關(guān) 動(dòng)物體內(nèi)維生素 K 分布的研究則較為少見(jiàn)，因此 有必要建立適宜的分析技術(shù)，可同時(shí)在線分析天 然食品維生素 K 的分型、含量水平、分布特征，以 為進(jìn)一步探討不同形態(tài)維生素 K 的生理功能及 生物活性提供可能。本研究在現(xiàn)有維生素 K1 檢 測(cè)技術(shù)之上，重點(diǎn)針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜、含量水平相 對(duì)較低的樣品探討適宜的樣品提取技術(shù)和色譜分 離技術(shù)，以保證檢測(cè)方法的靈敏性和準(zhǔn)確性。

新鮮畜禽肉及其內(nèi)臟、雞 蛋、海 鮮 樣 品 于 2018 年 6—8 月購(gòu)自北京某大型超市，每種樣品 不少于 3 kg。樣品進(jìn)行必要的清洗并去除不可食 部分和雜物( 如血塊) ，均質(zhì)處理并混勻縮分，分 裝于樣品瓶中，－20 ℃ 冷凍保存直至分析。另購(gòu) 納豆凍干粉碎混勻后作為高含量 MK-7 樣品。

維生素 K1、MK-4 購(gòu)自 Sigma 公司，MK-7 來(lái) 自廣東雙駿生物科技有限公司，純度均≥99%。 取標(biāo)準(zhǔn)參考物用甲醇 ∶四氫呋喃( 9 ∶ 1，V /V) 溶解 并制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封后－20 ℃ 冰箱保存; 使用前進(jìn)一步稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，濃度分別 為 0. 01、0. 02、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40 μg /mL，過(guò)0. 22 μm 濾膜后備用。

皺褶假絲酵母脂肪酶( ≥700 U /g) 和木瓜蛋 白酶( 1. 5 ～ 10 U /g) ，購(gòu)自于 Sigma 公司，胰腺 α淀粉酶( 3000 U /g) 購(gòu)自 Megazyme 公司。另外準(zhǔn) 備色譜純無(wú)水乙醇、甲醇、異辛烷，和分析純四氫 呋喃、鹽酸、石油醚、乙醚等常用試劑。

2695 液相色譜儀配熒光檢測(cè)器、Empower 色 譜工作站( 均購(gòu)自 Waters 公司) ，SY-2230 恒溫振 蕩水浴器( 購(gòu)自賽伯樂(lè)儀器有限公司) ，KQ5200型超聲儀( 購(gòu)自昆山舒美公司) ，Heal Force Neofuge 18Ｒ 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)( 購(gòu)自力康生物 醫(yī)療科技控股有限公司) ，Heidolph Multi Ｒeax 渦 旋振蕩器( 購(gòu)自 Heidolph 公司) ，ＲV10 V-C 旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀、ＲC2 冷卻水循環(huán)裝置 ( 均 購(gòu) 自 IKA 公 司) ，METTLEＲ XS205DU ( 感 量 0. 01 mg，購(gòu) 自 Mettler-Toledo 公司) 和 204 系列電子分析天平 ( 感量 0. 1 mg，購(gòu)自 Mettler-Toledo 公司) 。

參照《國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素K1的測(cè) 定》( GB 5009. 158—2016) 和文獻(xiàn)方法，建立高 效液相色譜( high performance liquid chromatography， HPLC) 柱后衍生熒光法測(cè)定不同形式維生素 K，以 雞胗、雞蛋和納豆為試樣探討確定最佳提取條件和 最佳測(cè)定條件，并進(jìn)行方法驗(yàn)證。

取 3 g 均質(zhì)試樣，分別采用以下方 法進(jìn)行樣品前處理:

( 1) 酸水解: 試樣加入 10 mL 水、7. 5 mL 鹽酸溶液( 12 mol /L) ，于 121 ℃高壓水 解 10 min，取出冷卻后用乙醚、石油醚萃取。

( 2) 酶解: 試樣加入 5 mL 40 ℃ 溫水、5 mL 磷酸鹽緩 沖液( 0. 8 mol /L pH 8) 、0. 2 g 脂肪酶和/或蛋白 酶、淀粉酶，37 ℃ 振蕩水浴 2 h，取出后用異辛烷 萃取。試樣萃取液于 26 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)?吹干，用 甲 醇 ∶ 四 氫 呋 喃 ( 9 ∶ 1，V /V) 定 容，過(guò) 0. 22 μm濾膜后待測(cè)。

將維生素 K 混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 和試樣待測(cè)液注入連接了柱后鋅柱的 HPLC 色譜 儀，在 柱 溫 30 ℃，進(jìn) 樣 量 為 20 μL，流 動(dòng) 相 為 900 mL甲醇 ∶100 mL 四氫呋喃( 包含 5 mmol 冰乙 酸、11 mmol 氯化鋅、6 mmol 無(wú)水乙酸鈉) ，流速為 1 mL /min 的條件下，進(jìn)行維生素 K 色譜分離，根 據(jù)出峰時(shí)間、分離效果、基線水平比較 3 種色譜柱 的分 離 效 果: Atlantis T3 色 譜 柱 ( 4. 6 mm ×250 mm，5 μm ) 、Waters COＲTES-C18 色 譜 柱 ( 4. 6 mm× 150 mm，2. 7 μm) 配 COＲTES-C18 保護(hù) 柱( 3. 9 mm×5 mm，2. 7 μm) 和 Waters SymmetryC18( 3. 9 mm×150 mm，5 μm) 。

根據(jù)發(fā)射波長(zhǎng) 200 ～ 600 nm 和激發(fā)波長(zhǎng) 200 ～ 400 nm 波段內(nèi)維生素 K 混合標(biāo) 準(zhǔn)應(yīng)用液最強(qiáng)吸收峰確定熒光檢測(cè)條件。

按照方法學(xué)要求，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍; 根據(jù)儀器信噪比為 3 和 10 時(shí)的被測(cè)化合物濃度 推算檢出限、定量限; 根據(jù) 6 次平行測(cè)定確定方法 精密度; 按照樣品本底濃度的 50%、100%、200% 進(jìn)行三水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)確定方法準(zhǔn)確度，若本 底濃度為 0，則按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的低、中、高三點(diǎn)的 濃度( 50、100 和 200 ng /mL) 進(jìn)行 3 水平加標(biāo)回收 實(shí)驗(yàn)確定方法準(zhǔn)確度。

按照已建立方法，對(duì)肉、蛋、水產(chǎn)品等樣品進(jìn) 行維生素 K 定量分析，所有樣品為 2 次平行測(cè) 定，結(jié)果以均值表示。

采用 Excel 2013 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行編輯，結(jié)果以 x 珋±s 表示。采用 SAS 9. 4 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，提取效 果的比較采用方差分析，以 P＜ 0. 05 為差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)過(guò)熒光光譜掃描，證明維生素 K1、MK-4、 MK-7 在發(fā)射波長(zhǎng) 410. 3 nm 有最大吸收峰，而激 發(fā)波長(zhǎng) 230 nm 和 320 nm 時(shí)有 2 個(gè)吸收峰，以 320 nm 處最高 。以此為檢測(cè)波長(zhǎng)，比較 3 種色譜柱對(duì)維生素 K 混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的分離效果，發(fā) 現(xiàn) Atlantis T3 色譜柱可在 25 min 內(nèi)有效實(shí)現(xiàn)不同 形式維生素 K 的色譜分離 ，出峰時(shí)間分 別為 8 min( MK-4) 、11 min ( 維生素 K1 ) 、22 min ( MK-7) ; 而采用 COＲTES-C18和 Symmetry-C18色譜 柱雖然出峰時(shí)間快，但是 MK-4 與雜峰之間基線 分離不清會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)，因 此選擇 Atlantis T3 色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

目前有關(guān)食物中維生素 K1 的測(cè)定技術(shù)比較 成熟。由于維生素 K1 主要來(lái)自于植物的綠葉，含量非常豐富，加上其極性較弱，很容易通過(guò)反相色 譜進(jìn)行分離， 并采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于 基質(zhì)較為復(fù)雜且含量較低的嬰幼兒配方食品，則 可利 用 維 生 素 K1 能 被 鋅 粉 還 原 產(chǎn) 生 氫 鯤 ( K1H2 ) ，而氫鯤可通過(guò)熒光儀進(jìn)行測(cè)量，無(wú)論是 AOAC 方法還是國(guó)標(biāo)方法 都依據(jù)了這一原 理。隨著對(duì)維生素 K2 生理功能方面的研究日益 增多，特別是 GB 14880—2012已經(jīng)許可將來(lái)自 納豆的維生素 K2( MK-7) 作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使 用，開(kāi)展不同形式維生素 K 測(cè)定的技術(shù)研究勢(shì)在 必行。考慮到維生素 K1 與維生素 K2 都是萘醌衍 生物以及熒光檢測(cè)器具有更高的靈敏度和特異 度，于是嘗試建立高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí) 在線分析不同形式維生素 K。